Rhizomucor miehei

Rhizomucor miehei: una referencia integral

1. Identidad, taxonomía y clasificación

Nomenclatura y sinónimos

Rhizomucor miehei (Cooney & R. Emers.) es un hongo filamentoso termófilo perteneciente al reino Fungi. Según el NCBI Taxonomy Browser, su linaje completo lo ubica dentro de organismos celulares → Eukaryota → Opisthokonta → Fungi → Mucoromycota → Mucoromycotina → Mucoromycetes → Mucorales → Lichtheimiaceae → Rhizomucor. El material tipo está designado bajo números de acceso de colecciones de cultivo que incluyen CBS 182.67 y ATCC 16457.

Debido a que el género Mucor ha experimentado, y seguramente seguirá experimentando, cambios taxonómicos sustanciales, la literatura reporta un gran número de denominaciones erróneas de especies. Entre las más citadas, Rhizomucor miehei aparece con frecuencia como Mucor miehei, su antiguo nombre. Esta nomenclatura más antigua todavía se encuentra en toda la literatura científica y comercial, y ambos nombres se refieren al mismo organismo.

Posición taxonómica dentro de Rhizomucor

El género Rhizomucor es un hongo filamentoso cosmopolita que se encuentra en el suelo y en frutas y verduras en descomposición. En su clasificación actual, Rhizomucor alberga únicamente especies termófilas con temperaturas máximas de crecimiento superiores a 50 °C y temperaturas mínimas de crecimiento inferiores a 20 °C. Estas especies, incluyendo Rm. miehei, Rm. pusillus, Rm. nainitalensis y Rm. pakistanicus, poseen esporangiosporas subglobosas a corto-elipsoidales.

Rhizomucor miehei es homotálico, mientras que Rhizomucor pusillus es homo- o heterotálico. La temperatura máxima de crecimiento, el perfil bioquímico de asimilación, la dependencia de la tiamina y el diámetro de los esporangios ayudan a diferenciar entre sí a las tres especies de Rhizomucor.

Morfología

Las colonias de Rhizomucor crecen muy rápidamente, llenan la placa de Petri y maduran en aproximadamente cuatro días. La textura es típicamente similar al algodón de azúcar. Vista desde el frente, la colonia es blanca inicialmente y se vuelve gris a marrón amarillenta con el tiempo, mientras que el reverso es blanco a pálido.

La morfología microscópica de Rhizomucor parece ser intermedia entre la de Rhizopus y Mucor. Se visualizan hifas anchas no septadas o escasamente septadas, rizoides rudimentarios, esporangióforos, esporangios y esporangiosporas. Todas las cepas son homotálicas, formando numerosas zigosporas de color marrón rojizo a marrón negruzco, globosas a ligeramente comprimidas, de hasta 50 µm de diámetro, con verrugas estelares y células suspensoras iguales. El color de la colonia es gris sucio en lugar de marrón, y los esporangios tienen paredes espinosas de hasta 50-60 µm de diámetro, con columelas rara vez mayores de 30 µm de diámetro. El crecimiento se estimula con tiamina, sin asimilación de sacarosa, y la temperatura máxima de crecimiento es de 54-58 °C.

Las especies de Rhizomucor consisten en hongos similares a Mucor que producen esporangios no apofisados y esporangióforos ramificados, pero, a diferencia de Mucor, forman rizoides. El género Rhizomucor se distingue de Mucor por la presencia de estolones y rizoides poco desarrollados en la base de los esporangióforos, y por la naturaleza termófila de sus especies.

Carácter termófilo y rango de crecimiento

Los hongos zigomicetos como Rhizomucor miehei han sido ampliamente explotados para la producción de diversas enzimas. Como hongo termófilo, R. miehei es capaz de crecer a temperaturas que se aproximan a los límites superiores para todos los eucariotas. En condiciones experimentales, esta especie crece particularmente bien a temperaturas entre 24 y 55 °C, y el crecimiento se vuelve insignificante por debajo de 21 °C o por encima de 57 °C.

Genoma

El genoma ensamblado de R. miehei CAU432 tiene 27,6 millones de pares de bases (Mb), con 10.345 genes codificantes de proteínas predichos. Aunque es termófilo, el contenido de G+C del genoma fúngico completo (43,8%) y de los genes codificantes (47,4%) son ambos inferiores al 50%. El genoma de R. miehei alberga un gran número de genes que codifican proteasas secretadas, en consonancia con su reputación como productor rico de proteasas. El perfil transcriptómico también mostró que los genes responsables de la degradación de almidón, glucano, proteína y lípidos se expresaban en niveles elevados.

2. Fuentes naturales, ecología y hábitat

Rhizomucor es un hongo filamentoso cosmopolita que se encuentra en el suelo y en frutas y verduras en descomposición. Aunque las especies de Rhizomucor a menudo se aíslan de materia orgánica en fermentación y compostaje, también son causas raras de infecciones graves y a menudo fatales en humanos. Estos organismos son hongos filamentosos ambientales que generalmente se encuentran alrededor de material orgánico en descomposición. Sus hifas son muy anchas, en forma de cinta, y tienen poca o ninguna septación, con ramificación en ángulos de 90°.

Los hongos termófilos son productores importantes de enzimas termoestables que pueden utilizarse en bioprocesos industriales a altas temperaturas. El carácter termófilo de R. miehei no es simplemente una adaptación ecológica, sino también la propiedad que hace que sus enzimas sean industrialmente atractivas, ya que estas proteínas son inherentemente más estables a las temperaturas elevadas utilizadas en muchos procesos de fabricación.

3. Formas comunes, preparaciones y productos comerciales

La lipasa de Rhizomucor miehei (RML), anteriormente conocida como lipasa de Mucor miehei, está disponible comercialmente tanto en forma soluble como inmovilizada, con una actividad muy alta y buena estabilidad bajo diversas condiciones, incluyendo solventes orgánicos anhidros y fluidos supercríticos. Está disponible comercialmente en formas tanto solubles como inmovilizadas, por ejemplo bajo el nombre comercial Lipozyme RM IM.

La enzima alimentaria mucorpepsina (EC 3.4.23.23) se produce con la cepa no modificada genéticamente de Rhizomucor miehei DSM 29547 por Chr. Hansen. La enzima alimentaria está libre de células viables del organismo de producción y está destinada al uso en el procesamiento lácteo para la producción de queso.

Una preparación adicional, la mucorpepsina (EC 3.4.23.23), se produce con la cepa no modificada genéticamente de Rhizomucor miehei FRO por DSM Food Specialties B.V. La enzima puede modificarse químicamente para producir una forma termolábil. La enzima alimentaria está libre de células viables del organismo de producción, y está destinada al uso en tres procesos de fabricación de alimentos: procesamiento de productos lácteos para la producción de (1) queso, (2) caseína de cuajo comestible, y (3) productos lácteos fermentados.

En el contexto de los suplementos dietéticos y los alimentos funcionales, R. miehei aparece principalmente como un organismo fuente para preparaciones enzimáticas purificadas —principalmente la lipasa (RML) y la proteasa (mucorpepsina/cuajo microbiano)— más que como un suplemento de organismo completo. La enzima lipasa de Rhizomucor miehei expresada en Aspergillus oryzae se utiliza en la producción de grasas especiales, la producción de grasas existentes a partir de nuevas materias primas, o nuevas grasas con cualidades nutricionales o funcionales mejoradas.

4. Uso tradicional e histórico

Es importante señalar que no existe un registro etnobotánico o médico tradicional documentado para Rhizomucor miehei como organismo recolectado intencionalmente y utilizado en la medicina popular o tradicional. Su historia de uso es principalmente industrial y de tecnología alimentaria por naturaleza, arraigada en la micología aplicada y la tecnología enzimática de mediados del siglo XX, más que en cualquier tradición médica preindustrial.

Hacia mediados del siglo XX, los científicos y productores de queso desarrollaron el cuajo microbiano como alternativa al cuajo animal. El cuajo microbiano es producido por ciertos mohos u hongos que crean naturalmente enzimas coagulantes de la leche. Mohos como Rhizomucor miehei o Rhizomucor pusillus pueden generar enzimas proteasas que imitan a la quimosina. Estos hongos se cultivan en tanques de fermentación, luego la enzima se extrae y purifica para su uso en la elaboración de queso. El resultado es un cuajo que no involucra ingredientes de origen animal, por lo que es apto para vegetarianos y también aceptable para queso kosher y halal cuando se prepara adecuadamente. Los cuajos microbianos se hicieron populares porque son menos costosos y evitan las limitaciones de suministro de los estómagos de terneros.

En la década de 1970, Chr. Hansen desarrolló coagulantes microbianos para satisfacer la necesidad de la industria de un componente de elaboración de queso más asequible y consistente. Hannilase es el nombre comercial de Chr. Hansen para Rhizomucor miehei, un hongo que cumple la misma función que el cuajo de origen animal pero que se deriva completamente de fuentes no animales. Esta enzima microbiana ha sido una bendición para los productores de queso.

Las aplicaciones tecnológicas alimentarias de las enzimas de R. miehei surgieron así en un contexto industrial específico durante la segunda mitad del siglo XX y fueron impulsadas por consideraciones comerciales y de cadena de suministro, más que por prácticas médicas tradicionales documentadas. No se ha identificado ningún uso médico-tradicional o preindustrial verificable de este organismo específico en la literatura revisada por pares o regulatoria.

5. Componentes clave y compuestos activos

Basándose en la existencia de un amplio repertorio de genes amilolíticos, proteolíticos y lipolíticos en el genoma, R. miehei tiene potencial en la producción de una variedad de dichas enzimas. Los principales compuestos biológica y comercialmente activos producidos por este organismo se describen a continuación.

5.1 Lipasa (Lipasa de Rhizomucor miehei, RML; EC 3.1.1.3)

Una lipasa fúngica (lipasa de Rhizomucor miehei; RML) de R. miehei es un biocatalizador altamente versátil utilizado en aplicaciones de laboratorio y comerciales/industriales. La RML es una proteína de cadena única de tipo α/β con un peso molecular de aproximadamente 31,6 kDa, compuesta por 269 residuos de aminoácidos.

La lipasa de Rhizomucor miehei pertenece a la familia de las lipasas de triglicéridos (EC 3.1.1.3), llamadas lipasas de clase 3, que son miembros de la superfamilia de hidrolasas α/β que hidrolizan los enlaces éster de los triglicéridos.

Mecanismo catalítico y características estructurales: El centro catalítico de la enzima está formado por una constelación de tres residuos —His-257, Asp-203 y Ser-144— similar en estructura y función a la tríada análoga (pero no homóloga) que se encuentra en ambas familias conocidas de proteinasas de serina. El sitio catalítico está oculto bajo una hélice anfipática corta (residuos 85-91), que actúa como una tapa, abriendo el sitio activo cuando la enzima se adsorbe en la interfase aceite-agua.

La RML fue la primera lipasa cuya estructura fue reportada, y su activación interfacial es muy conocida, lo que hace de esta enzima una buena plantilla para estudios de modelado. La lipasa de Rhizomucor miehei es probablemente la lipasa más utilizada obtenida de hongos, y se ha usado incluso como modelo para la determinación de la estructura de otras lipasas, debido al profundo conocimiento de su estructura tridimensional.

El gen de la lipasa de R. miehei codifica una lipasa 1,3-específica, y la enzima es capaz de catalizar la metanólisis del aceite de soja, mostrando una fuerte especificidad posicional en las posiciones sn-1 y sn-3 de los triglicéridos.

El punto isoeléctrico de la lipasa de Rhizomucor miehei es de aproximadamente 3,8.

5.2 Proteasa aspártica / Mucorpepsina (EC 3.4.23.23)

La proteasa de Rhizomucor miehei es el sustituto de cuajo más utilizado entre las fuentes microbianas, ostentando el 35% de la cuota de mercado de coagulantes en Francia. Es una proteasa aspártica (EC 3.4.23.23) con una única cadena polipeptídica, y tiene una disposición estructural muy similar a la de la quimosina.

La función principal de la proteasa en la elaboración de queso es iniciar el proceso de coagulación de la leche mediante la escisión rápida y altamente específica de las principales proteínas de la leche (caseína). Se ha demostrado que la mucorpepsina (EC 3.4.23.23) producida por Rhizomucor miehei es un sustituto suficiente del cuajo tradicional, debido a su alta especificidad para escindir el enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína, de forma similar al rendimiento de la quimosina.

5.3 Alfa-amilasa (RmAmyA)

Se ha expresado una novedosa α-amilasa termoestable de Rhizomucor miehei en Pichia pastoris. Se obtuvo una alta actividad enzimática de 29.794,2 U/mL mediante fermentación de alta densidad celular, y el almidón licuado fue sacarificado por esta α-amilasa para producir jarabe de alta maltosa (54%). El gen de la α-amilasa (RmAmyA) de Rhizomucor miehei fue clonado y expresado en Pichia pastoris; RmAmyA mostró un 70% de identidad de aminoácidos con la α-amilasa de Rhizomucor pusillus.

5.4 Esterasa

La investigación también ha identificado una esterasa de R. miehei. Las esterasas con un amplio rango de especificidad hacia sustratos no naturales y alta estabilidad en solventes orgánicos son útiles para una variedad de aplicaciones industriales, incluyendo como aditivos en el procesamiento de grasas y aceites, en detergentes para lavandería, en la síntesis de productos químicos finos y farmacéuticos, y en la fabricación de cosméticos, así como para la producción de ésteres saborizantes en la industria alimentaria.

5.5 Repertorio enzimático adicional

La información genómica de R. miehei facilitará futuros estudios para comprender mejor los mecanismos de adaptación termófila fúngica y el potencial de R. miehei en la producción a escala industrial de enzimas termoestables. Basándose en la existencia de un amplio repertorio de genes amilolíticos, proteolíticos y lipolíticos en el genoma, R. miehei tiene potencial en la producción de una variedad de dichas enzimas. La investigación también ha identificado actividad de xiloglucanasa con aplicaciones potenciales en el procesamiento de alimentos, como la producción de yogur.

6. Mecanismos de acción

6.1 Mecanismo lipolítico (activación interfacial)

El sitio catalítico de la RML se ha localizado en el dominio amino-terminal de la enzima, que contiene la tríada catalítica Ser144, His257 y Asp203. La lipasa tiene un mecanismo de acción peculiar llamado activación interfacial. En medios homogéneos, el sitio activo de la lipasa está cubierto por una cadena polipeptídica llamada tapa, que desempeña un papel protector.

Se asumió que el movimiento típico de la tapa sigue un mecanismo de apertura en dos pasos que primero da lugar a una conformación semiabierta al adsorberse en la interfase, seguida de una apertura completa de la tapa al unirse el sustrato. Una vez que la tapa se abre, la tríada catalítica del sitio activo (Ser-His-Asp) queda expuesta y puede catalizar la hidrólisis, esterificación o transesterificación de los enlaces éster de ácidos grasos.

Las lipasas son una clase de hidrolasas ampliamente distribuidas entre microorganismos, plantas y animales. Su función natural es catalizar la hidrólisis de los enlaces éster del glicerol, y —debido a la reversibilidad de la reacción— también la síntesis de ésteres de glicerol. La mayoría son hidrolasas de serina que contienen un residuo de serina en su sitio activo, como el residuo principal de la tríada clásica Ser…His…Asp (Glu).

6.2 Mecanismo proteolítico (coagulación de la leche)

La proteasa mucorpepsina funciona como una proteasa aspártica, lo que significa que su mecanismo catalítico implica dos residuos de aspartato en el sitio activo que cooperan para mediar el ataque nucleofílico sobre el enlace peptídico. Se ha demostrado que la mucorpepsina producida por Rhizomucor miehei es un sustituto suficiente del cuajo tradicional, debido a su alta especificidad para escindir el enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína, de forma similar al rendimiento de la quimosina.

Algunos mohos como Rhizomucor miehei son capaces de producir enzimas proteolíticas. Estos mohos se producen en un fermentador y luego se concentran y purifican especialmente para evitar la contaminación con subproductos desagradables del crecimiento del moho.

7. Evidencia científica por área de uso

7.1 Procesamiento lácteo y producción de queso (tecnología alimentaria)

La aplicación más ampliamente estudiada y documentada de las enzimas de R. miehei es como sustituto de cuajo microbiano en la elaboración de queso. Este representa el ámbito con la base de evidencia más sólida, aunque es de naturaleza industrial-tecnológica más que clínica.

La proteasa de Rhizomucor miehei es el sustituto de cuajo más utilizado entre las fuentes microbianas. Es una proteasa aspártica (EC 3.4.23.23) con una única cadena polipeptídica y una disposición muy similar a la de la quimosina. Se comprobó que el queso producido con la proteasa obtenida de Rhizomucor miehei era igual al producido con renina de ternero en términos de rendimiento y calidad.

En un estudio comparativo de queso blanco ultrafiltrado iraní producido utilizando diferentes mezclas de cuajo microbiano de R. miehei y quimosina de camello, madurado durante 90 días, los resultados mostraron que el pH, la grasa en materia seca, la sal en materia seca y el contenido de proteína de los quesos fueron significativamente influenciados por el tipo y la concentración del coagulante. La diferencia entre las actividades proteolíticas de los dos coagulantes resultó en diferentes niveles de proteólisis. Se determinó una relación directa entre el uso de mayores concentraciones de R. miehei y el aumento de la hidrólisis de la αs1-caseína en los quesos durante la maduración.

Una limitación práctica clave de la proteasa nativa de R. miehei es su termoestabilidad, que, aunque útil industrialmente, presenta un desafío para ciertas aplicaciones queseras. La visión tradicional es que estos coagulantes producen amargor y bajo rendimiento en el queso, especialmente cuando se envejece durante mucho tiempo. Sin embargo, a lo largo de los años, los coagulantes microbianos han mejorado enormemente, en gran parte debido a la caracterización y purificación de enzimas secundarias responsables de la formación de péptidos amargos y de la degradación proteolítica no específica en quesos de larga maduración. Se han desarrollado comercialmente formas termolábiles (desestabilizadas por calor) de la proteasa nativa para abordar este problema.

Fortaleza de la evidencia: Sólida para la aplicación tecnológica en la producción láctea/quesera, respaldada por numerosos estudios revisados por pares en ciencia de los alimentos y múltiples evaluaciones regulatorias de la EFSA. No existe evidencia clínica (es decir, ensayos controlados aleatorizados en humanos que evalúen resultados de salud) para esta aplicación.

7.2 Modificación de grasas y aceites (producción de lípidos especiales)

La lipasa de Rhizomucor miehei (RML) es una enzima disponible comercialmente tanto en formas solubles como inmovilizadas, con una actividad muy alta y buena estabilidad bajo diversas condiciones experimentales. Sus usos se orientaron inicialmente hacia la industria alimentaria, donde la enzima ha encontrado una amplia aplicación. Los principales usos de la enzima en la modificación de ácidos grasos, aceites y grasas incluyen la hidrólisis de glicéridos, la transesterificación, la esterificación, la acidólisis y la interesterificación.

La enzima lipasa de Rhizomucor miehei expresada en Aspergillus oryzae se utiliza en la producción de grasas especiales, la producción de grasas existentes a partir de nuevas materias primas, y nuevas grasas con cualidades nutricionales o funcionales mejoradas.

Existen varios productos comerciales disponibles para esta aplicación, incluido Lipozyme® de Novozymes, una serie de productos de lipasa (por ejemplo, lipasa B de C. antarctica fabricada en A. niger o Thermomyces lanuginosus, o lipasa de Rhizomucor miehei fabricada en A. oryzae), que se utilizan como enzimas inmovilizadas para reducir las grasas trans en la margarina. La interesterificación enzimática proporciona una forma sencilla, eficiente y respetuosa con el medio ambiente de producir margarinas sin el uso de productos químicos.

Fortaleza de la evidencia: Sólida para la aplicación industrial. Los beneficios nutricionales de las grasas especiales producidas mediante RML (por ejemplo, margarinas con reducción de grasas trans, triglicéridos estructurados) están establecidos a nivel del producto alimentario, pero no se han identificado ensayos clínicos que atribuyan específicamente resultados de salud al uso de la lipasa derivada de R. miehei.

7.3 Producción de biodiésel

Aunque la lipasa de R. miehei se produjo inicialmente para ser utilizada en la industria alimentaria, una investigación considerable se ha centrado en su aplicación en química orgánica, desde la producción de biodiésel hasta productos químicos finos. El gen de lipasa 1,3-específico de Rhizomucor miehei expresado en Pichia pastoris produce una enzima capaz de catalizar la metanólisis del aceite de soja, mostrando una fuerte especificidad posicional. Esta no es una aplicación para la salud humana, pero se incluye aquí para completar el registro científico.

7.4 Suplementación enzimática digestiva (uso potencial como suplemento dietético)

En el mercado de suplementos dietéticos, las enzimas derivadas de R. miehei —particularmente la lipasa— aparecen como componentes de fórmulas digestivas multienzimáticas. El fundamento es que la capacidad de la lipasa para hidrolizar triglicéridos en la interfase aceite-agua puede aumentar la actividad de la lipasa pancreática endógena, mientras que la proteasa puede complementar la digestión de proteínas.

Más allá de la producción de queso, existe un interés creciente en el uso potencial de las enzimas de Rhizomucor miehei en otros productos nutricionales, como los hidrolizados de proteínas y las ayudas digestivas. Sin embargo, la investigación clínica que examine específicamente los beneficios para la salud en humanos sigue siendo limitada, y las afirmaciones sobre efectos nutricionales o terapéuticos directos requieren mayor investigación.

Fortaleza de la evidencia: Débil o inexistente a nivel clínico. No se identificaron ensayos clínicos controlados en humanos, revisados por pares, que evaluaran específicamente preparaciones enzimáticas derivadas de R. miehei como suplementos dietéticos para la salud digestiva, la absorción de grasas u otros resultados relacionados. La base mecanicista para un papel de enzima digestiva es bioquímicamente plausible, pero la evidencia actualmente se limita a datos in vitro y de ciencia alimentaria.

7.5 Producción de lípidos estructurados / grasas nutricionales especiales

La RML se utiliza en contextos de química fina y química de alimentos, incluyendo la síntesis orgánica enantio- o regioselectiva. Un área específica es la producción enzimática de triglicéridos estructurados —grasas con distribuciones definidas de ácidos grasos— que se han investigado para aplicaciones nutricionales como sustitutos de la grasa de la leche humana y nutrición clínica. La RML, dada su especificidad posicional 1,3, es una herramienta clave en la síntesis de dichos lípidos estructurados. Sin embargo, la base de evidencia para los beneficios de salud resultantes de los lípidos estructurados producidos con RML en humanos proviene de estudios de los propios productos de lípidos estructurados, no de la suplementación con la enzima.

7.6 Aplicaciones de la alfa-amilasa en la calidad alimentaria

La α-amilasa de R. miehei (RmAmyA) puede mejorar la calidad del pan cocido al vapor chino y prevenir su endurecimiento. Esto se ha demostrado en contextos de investigación de ciencia de los alimentos, pero no constituye una afirmación de suplemento dietético ni un hallazgo clínico de salud.

8. Sistemas corporales y áreas de salud asociadas con R. miehei

• Sistema digestivo (actividad enzimática): La lipasa y la proteasa producidas por R. miehei son mecanísticamente capaces de complementar la descomposición de las grasas y proteínas de la dieta, respectivamente. Este potencial cuenta con respaldo bioquímico, pero carece de evidencia de ensayos clínicos en humanos en el contexto de suplementos.
• Cardiovascular-metabólico (calidad de las grasas): El uso de la RML en la producción de grasas especiales con perfiles de ácidos grasos mejorados (por ejemplo, reducción de grasas trans en la margarina) tiene relevancia posterior en la nutrición lipídica y la salud cardiovascular a nivel poblacional a través de la reformulación de productos alimentarios.
• Respuesta inmune/alérgica (alergenicidad): Como se detalla en la Sección 9, los paneles de la EFSA han identificado un potencial de alergenicidad relevante para individuos sensibilizados a la mostaza o a ciertos alérgenos respiratorios.

9. Formas de dosificación y dosis reportadas en estudios

Debido a que las preparaciones derivadas de R. miehei se regulan principalmente como enzimas alimentarias en lugar de como ingredientes de suplementos dietéticos en la mayoría de las jurisdicciones, la caracterización formal de dosis tal como se utiliza en ensayos clínicos en humanos está en gran medida ausente. Los siguientes datos relacionados con dosis provienen exclusivamente de evaluaciones toxicológicas regulatorias:

• En pruebas toxicológicas de seguridad, concentraciones dietéticas de la lipasa de R. miehei (expresada en Aspergillus oryzae) de hasta 1.600 mg/kg de dieta durante hasta 13 semanas no causaron efectos adversos en ratas. A concentraciones más altas hubo efectos sobre la ingesta de alimentos, posiblemente derivados de alguna propiedad irritante de la preparación enzimática en la dieta a niveles tan elevados, con efectos consecuentes sobre el peso corporal y el metabolismo energético.
• En poblaciones europeas, la exposición dietética a la mucorpepsina (de la cepa DSM 29547 de R. miehei) proveniente de alimentos se estimó en hasta 0,26 mg de sólidos orgánicos totales (TOS)/kg de peso corporal por día.
• Para la mucorpepsina de la cepa FRO de R. miehei, la exposición dietética se estimó en hasta aproximadamente 0,072 mg TOS/kg de peso corporal por día en poblaciones europeas.
• Para la mucorpepsina de la cepa M19-21, la exposición dietética se estimó en hasta 0,108 mg TOS/kg de peso corporal por día en poblaciones europeas.

Estas cifras representan exposiciones dietéticas poblacionales estimadas a partir del consumo de queso, no dosis de suplementación intencional. No se identificaron estudios clínicos de búsqueda de dosis o de dosis-respuesta en humanos para el uso suplementario de las enzimas de R. miehei en la literatura revisada por pares.

10. Consideraciones de seguridad

10.1 Seguridad toxicológica (evaluaciones regulatorias)

La seguridad de las enzimas alimentarias derivadas de R. miehei se ha evaluado en múltiples estudios toxicológicos formales presentados y revisados por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA).

En las pruebas de seguridad de la preparación enzimática de lipasa de R. miehei expresada en A. oryzae, no se encontró que la preparación fuera mutagénica ni en cultivos bacterianos (prueba de Ames) ni en cultivos de células de mamíferos (ensayo de linfoma de ratón), ni causó daño cromosómico (ensayo de linfocitos humanos).

Para la mucorpepsina de la cepa DSM 29547, las pruebas de genotoxicidad no indicaron ninguna preocupación de seguridad. La toxicidad sistémica se evaluó mediante un estudio de toxicidad oral de dosis repetidas de 90 días en ratas. El Panel identificó un nivel sin efecto adverso observado (NOAEL) de 618 mg TOS/kg de peso corporal por día, la dosis más alta probada, que al compararse con la exposición dietética estimada resulta en un margen de exposición de al menos 2.400.

Para la mucorpepsina de la cepa FRO, el NOAEL se identificó en 2.000 mg TOS/kg de peso corporal por día, la dosis más alta probada, lo que resulta en un margen de exposición de al menos 27.778 en relación con la exposición dietética estimada.

Para la mucorpepsina de la cepa M19-21, el NOAEL fue de 226 mg TOS/kg de peso corporal por día, la dosis más alta probada, lo que resulta en un margen de exposición de al menos 2.093 en relación con la exposición dietética estimada.

Con base en los datos proporcionados, los paneles de la EFSA concluyeron que tanto las formas nativas como termolábiles de las enzimas alimentarias de mucorpepsina no generan preocupaciones de seguridad bajo las condiciones de uso previstas.

10.2 Alergenicidad

El perfil de alergenicidad de las enzimas derivadas de R. miehei ha sido un foco constante de las evaluaciones de seguridad de la EFSA.

La alergenicidad potencial de la mucorpepsina de la cepa DSM 29547 se evaluó comparando su secuencia de aminoácidos con las de alérgenos conocidos. Utilizando como criterio una identidad superior al 35% en una ventana deslizante de 80 aminoácidos, se encontraron tres coincidencias: la pepsina A de Sus scrofa, una aspergilopepsina de Aspergillus fumigatus, y una proteína de transferencia de lípidos (Sin a 3.01) de la mostaza amarilla (Sinapis alba).

No hay información disponible sobre sensibilización oral y respiratoria o reacciones de provocación causadas por esta mucorpepsina específica. La pepsina de Sus scrofa, así como la aspergilopepsina, están asociadas con asma y rinitis ocupacionales.

Para la mucorpepsina de la cepa FRO, se encontraron cinco coincidencias con alérgenos conocidos. El Panel consideró que no se puede excluir un riesgo de reacciones alérgicas ante la exposición dietética a esta enzima alimentaria, pero se considera bajo, excepto para los individuos sensibilizados a las proteínas de la mostaza, para quienes el riesgo no excederá al del consumo de mostaza.

Para la mucorpepsina de la cepa LP-N836, se encontraron cuatro coincidencias con alérgenos respiratorios y una con un alérgeno alimentario (mostaza). El Panel consideró que no se puede excluir el riesgo de reacciones alérgicas ante la exposición dietética, particularmente en individuos sensibilizados a las proteínas de la mostaza.

El Panel de la EFSA consideró que, bajo las condiciones de uso previstas, no se puede excluir el riesgo de sensibilización alérgica y reacciones de provocación por exposición dietética, pero se considera bajo, excepto para los individuos sensibilizados a las proteínas de la mostaza, aunque este riesgo no excederá al del consumo de mostaza.

10.3 Exposición ocupacional y riesgo de inhalación

Se sabe desde hace mucho tiempo que la exposición al polvo de enzimas causa hipersensibilidades inmediatas ocupacionales. Se ha revisado la literatura relativa a la sensibilización ocupacional de las vías respiratorias debido al cuajo natural y microbiano, y varios estudios han demostrado claramente casos de sensibilización específica de las vías respiratorias causada por el cuajo. Se han descrito pruebas cutáneas de punción y de provocación positivas, así como anticuerpos IgE específicos, lo que sugiere un mecanismo inmunológico.

Este riesgo ocupacional es relevante para los trabajadores en la fabricación de enzimas y la producción de queso que pueden estar expuestos a partículas de enzimas en el aire, no para los consumidores de alimentos o suplementos que contienen enzimas.

10.4 Ausencia de organismo viable en las preparaciones comerciales

Una consideración clave de seguridad y regulación es que las preparaciones comerciales de enzimas alimentarias derivadas de R. miehei se producen bajo condiciones de fermentación y luego se purifican. La enzima alimentaria está libre de células viables del organismo de producción. Esto significa que los productos de consumo no contienen células vivas de R. miehei, lo que limita el riesgo de infección por parte del organismo de producción en sí.

10.5 Potencial patógeno del organismo

Si bien las preparaciones enzimáticas son seguras para uso alimentario, es relevante señalar la biología más amplia del organismo. Rhizomucor miehei es un patógeno humano raro. Se ha reportado en casos de infección de tipo pulmonar, diseminado y cutáneo. Se asocia con mayor frecuencia a enfermedades animales, especialmente el aborto bovino. Las especies de Rhizomucor se encuentran entre los hongos que causan el grupo de infecciones denominado zigomicosis. Aunque el término mucormicosis se ha utilizado a menudo para este síndrome, zigomicosis es el término preferido para esta enfermedad angioinvasiva. Este potencial patógeno es clínicamente relevante principalmente para individuos gravemente inmunocomprometidos y es distinto de cualquier riesgo asociado con el consumo de preparaciones enzimáticas purificadas y libres de células de este organismo.

10.6 Ausencia de células viables y estatus OGM de las cepas

Múltiples preparaciones evaluadas por la EFSA se producen a partir de cepas no modificadas genéticamente de R. miehei (por ejemplo, las cepas DSM 29547, FRO, M19-21, LP-N836). Sin embargo, algunas aplicaciones comerciales involucran la expresión de genes enzimáticos de R. miehei en hospedadores heterólogos como Aspergillus oryzae o Pichia pastoris, que los reguladores clasifican por separado. En todos los casos evaluados, se reportó que las preparaciones finales de enzimas alimentarias estaban libres de células viables del organismo de producción.

Resumen de la fortaleza de la evidencia

• Elaboración de queso / coagulación de la leche: Sólida — múltiples estudios de ciencia alimentaria, uso comercial de larga data desde la década de 1970, múltiples expedientes de seguridad de la EFSA.
• Modificación de grasas y aceites (incluida la reducción de grasas trans en la margarina): Sólida — biotecnología industrial ampliamente caracterizada; el beneficio nutricional de los productos resultantes está establecido, pero no proviene del suplemento enzimático en sí.
• Producción de lípidos estructurados: Moderada a nivel de ciencia alimentaria; la evidencia clínica de los productos alimentarios resultantes es independiente de la preparación enzimática.
• Suplementación enzimática digestiva (uso como suplemento dietético): Débil / insuficiente — mecanísticamente plausible con base en la bioquímica de la enzima; no se identificaron ensayos clínicos en humanos.
• Alfa-amilasa / procesamiento de carbohidratos: Preliminar — demostrado en sistemas in vitro y modelos alimentarios; sin datos clínicos en humanos.

Referencias

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